Potenciál onkolytické viroterapie v léčbě nádorových onemocnění u psů

Stoletá myšlenka

Použití virů k eliminaci nádorových buněk zaznamenává v poslední době nárůst zájmu, a to především v humánní medicíně. Nicméně samotná myšlenka je stará již více než 100 let. Na počátku 20. století byla zaznamenána remise leukémie u ženy, která prodělala respirační onemocnění (pravděpodobně chřipku). S postupem času a pokrokem výzkumu byli vědci schopni vyvinout rekombinantní viry, které již nejsou patogenní, ale přitom se silněji zaměřují na nádorové buňky, mají výraznější onkolytické vlastnosti a/nebo žádoucí imunologické vlastnosti. V humánní medicíně tak již v některých zemích existují schválené viry k léčbě některých druhů malignit.

Onkolytická viroterapie u psů

U psů byla onkolytická viroterapie zatím spíše okrajovou záležitostí, ale poté, co řada studií, které měly původně zajímavé výsledky na xenograftových myších modelech, následně selhala u lidí, se vědci zaměřili na psy a studie na nich. Psí genom je velmi dobře prostudován, psi i lidé jsou obdobně vystaveni faktorům prostředí ovlivňujících tumorigenezi a biologické chování některých typů nádorů u psů je obdobné klinickému průběhu onemocnění pozorovaného u lidí. Model psa však může posloužit nejen pro studium onkolytické viroterapie u lidí, ale současně také pro vývoj účinné terapie samotných psích onkologických pacientů.

Mechanismus působení

I když existují viry schopné přímo vyvolat smrt nádorových buněk, hlavním mechanismem účinků onkolytických virů je aktivace imunitního systému, navíc u myších xenograftů byla prokázána následná protinádorová imunitní paměť bránící nádorovým buňkám v opětovném růstu. Výhodou onkolytických virů je také možnost jejich genetické úpravy tak, aby bylo dosaženo exprese specifických exogenních proteinů podporujících jejich protinádorové působení.

Řada publikací naznačuje, že onkolytické viry se mohou množit a působit lýzu psích nádorových buněk v kulturách. Úspěšné byly i studie na myších xenograftech s nádorovými buňkami od psů. U psů byly určeny a testovány jako onkolytické viry adenoviry, paramyxoviry, poxviry, reoviry a togaviry.

Adenoviry

Adenoviry testované na buněčných kulturách psího osteosarkomu a v xenograftech

Jedním ze zkoumaných adenovirů byl CRAd5. Genetické úpravy tohoto lidského adenoviru, spočívající v zavedení některých funkčních komponent psího adenoviru CAV2, vedly ke zlepšení replikace CRAd5 v nádorových buňkách psího osteosarkomu in vitro a in vivo (u myší s xenografty psího osteosarkomu), zatímco bez genetických úprav se tento virus v buněčných kulturách psích buněk množil jen mírně. Obdobný účinek in vitro a in vivo v myším modelu psího osteosarkomu vykazoval také CRAd po zavedení genu pro protein p53. Geneticky modifikovaný CAV2 (OC-CAVE₁) byl schopen vyvolat apoptózu in vitro a zlepšil klinické výsledky u myší s xenografty psího osteosarkomu.

Replikačně deficientní adenoviry u onkologických psích pacientů

Replikačně deficientní Ad6 virus (Ad6-dTERT) byl použit jako doplněk chemoterapie a DNA vakcinace v klinickém pokusu pro léčbu lymfomu B buněk u psů. Psi, kteří podstoupili také vakcinaci, měli významně delší čas přežití ve srovnání s těmi, kteří podstoupili pouze chemoterapii.

Velmi dobré výsledky byly pozorovány i u psů s astrocytomem, a to po částečné chirurgické resekci následované intratumorální aplikací adenoviru s expresí interferonu gama (Ad-IFN-γ) a vakcinací pomocí nádorového homogenátu. 

U těchto virů byly zaznamenány také pozitivní výsledky v terapii melanomů. Po intratumorální aplikaci viru Ad5 exprimujícího ligand CD40 došlo k ústupu nádorů u obou testovaných psů (orální melanom, melanom víčka). V kombinaci s následným chirurgickým odstraněním nebo imunoterapií byla v další studii u většiny pacientů zaznamenána v nádorech infiltrace lymfocyty. U 5 z 19 pacientů došlo k úplné remisi, u 8 byla zaznamenána parciální odpověď, u 4 nedošlo k žádné změně stavu a u 2 došlo k progresi melanomu. 

CAV2 u onkologických psích pacientů

Rekombinantní viry adenoviru typu 2 (CAV2) byly testovány in vitro, in vivo v hlodavčích modelech i v klinické studii − v té byla psům aplikována minimálně 1 dávka 10¹² virových částic. Na léčbu reagovali někteří psi s osteosarkomem, karcinomem jater, kožním mastocytomem, subkutánním fibrosarkomem a adenomem potní žlázy. Z nežádoucích účinků se vyskytly otoky a krvácení v místě aplikace. U psa s mastocytomem se rozvinula diseminovaná intravaskulární koagulopatie. Nejlepší klinický výsledek byl zaznamenám u psa s fibrosarkomem (možnost totální resekce po virové terapii) a u psa s adenomem potní žlázy (parciální odpověď po dobu 6 měsíců).

Paramyxoviry

Paramyxoviry infikují a poškozují lymfocyty. Při správné modifikaci by tak mohly sloužit k terapii lymfomů. U psů byl testován virus spalniček a virus psinky, přičemž virus psinky byl schopen infikovat některé buněčné linie psích lymfoidních buněk a nádorové lymfoidní buňky. 

Poxviry

Poxviry jsou díky svým vlastnostem hodnoceny jako excelentní onkolytické viry:

• Na rozdíl od jiných virů nepotřebují pro vstup do buňky specifický receptor.
• Díky své velikosti útočí přednostně na nádorové buňky v místě neovaskularizace.
• Jsou výbornými přenašeči pro expresi exogenních proteinů.
• Viriony jsou uvolňovány z infikovaných buněk ještě před jejich vlastní lýzou, a sousední nádorové buňky jsou tak efektivně napadány.
• Vyvolávají silnou imunitní odpověď, která zabraňuje vzniku latentní či rekurentní infekce.

Rekombinantní virus vakcinie (rVACV)

Tento virus patří mezi nejpoužívanější poxviry v onkolytické viroterapii. Prokázal řadu pozitivních výsledků na myších s xenografty lidských nádorů a také v několika klinických studiích u lidí. Použití VACV bylo zkoumáno také u psích nádorových buněčných linií in vitro a in vivo (nádory mléčné žlázy, sarkomy, karcinom prostaty). V těchto experimentech se virus úspěšně replikoval v nádorových buňkách a signifikantně snížil velikost nádoru. Na druhou stranu se však u myší pomnožil také v játrech, plicích, slezině, vaječnících a ledvinách, u některých pokusných zvířat byl zaznamenán i úbytek hmotnosti.

Další modifikace VACV (LIVP 6.1.1) vedla ve studiích k buněčné smrti nádorových buněk psího sarkomu, melanomu, osteosarkomu a nádoru prostaty. U myších xenograftů pak tento virus efektivně redukoval růst nádoru psího sarkomu měkkých tkání a karcinomu prostaty. Další modifikace tohoto viru (GLV-5b451) pak vedla k indukci buněčné smrti v psím sarkomu měkkých tkání, nádoru mléčné žlázy, karcinomu prostaty a k redukci růstu sarkomu měkkých tkání u myších xenograftů.

Rekombinantní VACV, u kterého byly vymazány geny kódující thymidinkinázu a růstový faktor vakcinie, vyvolal po intratumorální aplikaci v myším modelu zpomalení růstu psího nádoru prostaty.

Klinické studie terapie psů s nádory pomocí rekombinantních VACV v současné době probíhají na univerzitách ve Finsku a USA. 

Virus myxomatózy (MYXV)

Virus myxomatózy je schopen infikovat nádorové buňky mj. u psa a kočky. Bezpečnost rekombinantního viry myxomatózy (MYXVΔserp2) u psů se sarkomem měkkých tkání je v současnosti zkoumána na Coloradské univerzitě v USA. Již dříve však byl tento virus použit u 13leté feny labradora se subkutánním mastocytomem, které byl aplikován ve 2 dávkách intratumorálně (5× 10⁷ PFU). Nádor po těchto aplikacích vykazoval přítomnost nekróz, snížení počtu mastocytů a zvýšený počet plazmatických buněk ve srovnání s bioptátem před aplikacemi. U feny nebyly zaznamenány žádné příznaky onemocnění po aplikaci viru a odstraněný nádor se nevrátil ani po 20 měsících. 

Reoviry

Rekombinantní reoviry byly zkoumány především u mastocytomů, lymfomů, melanomů a karcinomů mléčné žlázy, kde v buněčných liniích vyvolaly apoptózu 72 hodin od inokulace a v myším modelu s xenografty mastocytomu a T lymfomu způsobily zpomalení růstu nádorů po intratumorální aplikaci. K infekci reovirem byly méně vnímavé buněčné linie osteosarkomu. 

Togaviry

Atenuovaný Semliki Forest virus vyvolal buněčnou smrt u 2 buněčných linií osteosarkomu a i. v. aplikace (2× 10⁵ CFU) jeho atenuované formy u bígla byla vyhodnocena jako bezpečná. 

Závěr

Předpokládá se, že onkolytické viry se mohou brzy stát novou účinnou možností léčby psích onkologických pacientů. Kromě ověření jejich účinnosti v klinických studiích však bude třeba ještě prohloubit znalosti virové biologie a biologie proteinů, jejichž geny byly rekombinantními technologiemi do terapeutických virů vneseny.

(kata)

Zdroj: MacNeill A. L. On the potential of oncolytic virotherapy for the treatment of canine cancers. Oncolytic Virother 2015; 26; 4: 95−107, doi: 10.2147/OV.S66358.